Када експеримент не успе, да ли сте икада уперили прст у скупе реагенсе или сложене инструменте? Али понекад се прави „кривац“ можда тихо крије у углу - те наизглед обичне бочице пуферског реагенса. Иако је неупадљив, то је спас за одржавање тачности експеримента. Данас ћемо открити тајну овог „невидљивог чувара“.
Ⅰ. Пуфер: Шта је то? Зашто је неопходан у лабораторији?
Једноставно речено, пуфер је посебан систем раствора који може да се одупре ефектима мале количине додате киселине, алкалије или разблаживања и да одржава релативно стабилну пХ вредност раствора. Обично се састоји од пара „партнера“ - слабе киселине и њене коњугиране базе (или слабе базе и њене коњугиране киселине), као што су сирћетна киселина/натријум ацетат (ХАц/Ац-), натријум дихидроген фосфат/динатријум хидроген фосфат (НаХ/На₄ПО₄, итд.), који су уобичајени у. лабораторије.
Основна способност: Стабилизација пХ вредности и отпорност на промене!
Када се мала количина киселих или алкалних супстанци случајно унесе у експеримент, „партнер” у пуферу ће брзо реаговати, као ефикасан „чувар водоничних јона”, апсорбујући га или ослобађајући га, чиме се избегавају драстичне флуктуације пХ вредности раствора. Ова способност је неопходна за многе биохемијске реакције које се ослањају на специфично пХ окружење.
Ⅱ. Лабораторијска фаза: неизоставни протагониста и споредна улога
1. "Систем за одржавање живота" биохемијских експеримената:
Истраживање активности ензима:Већина ензима има оптималну активност само у уском пХ опсегу. Пуфери (као што су Трис-ХЦл, ПБС) обезбеђују стабилан „радни сто“ за ензимске реакције како би се обезбедили поуздани резултати.
Пречишћавање и анализа протеина:Од лизе ћелија, хроматографског одвајања (јонска размена, афинитетна хроматографија) до електрофорезе (као што је СДС-ПАГЕ), кристализације и складиштења протеина, сваки корак захтева пуфер са специфичним пХ да би се одржала структура, наелектрисање и растворљивост протеина и спречила денатурација или таложење.
Манипулација нуклеинском киселином:ПЦР реакција, екстракција ДНК/РНА, дигестија ензима, лигација, хибридизација и други процеси су изузетно осетљиви на пХ. Често коришћени пуфери као што је ТЕ (Трис-ЕДТА) могу да стабилизују структуру нуклеинских киселина и заштите их од разградње нуклеазе.
2. "Успаванка" ћелијске културе:Медијум ћелијске културе (као што је ДМЕМ, РПМИ) је сам по себи сложен систем пуфера (често се ослања на систем натријум бикарбоната/угљен-диоксида). Додавање додатних пуфера (као што је ХЕПЕС) може да обезбеди ћелијама стабилније пХ окружење, посебно када мењате течности, посматрате или када концентрације угљен-диоксида могу да варирају, како би се обезбедио здрав раст ћелија.
3. „Снага стабилизације“ аналитичке хемије:
Хроматографско раздвајање:У течној хроматографији високих перформанси (ХПЛЦ) и јонској хроматографији (ИЦ), пХ мобилне фазе је кључни контролни параметар за ефекат раздвајања, а пуфери (као што су фосфати и ацетати) обезбеђују поновљивост процеса раздвајања.
Анализа титрације:Неке реакције титрације треба да се спроведу при константном пХ или да укажу на крајњу тачку када се постигне одређени пХ, а пуфер игра стабилизујућу улогу.
Припрема стандардних раствора:пХ вредност многих стандардних раствора треба прецизно контролисати, а пуфери су основа.
Ⅲ. Избор и употреба: много знања
Изаберите прави систем бафера:
пКа вредност је кључна:Ефективни опсег пуферовања пуфера је обично унутар опсега његове пКа ± 1 вредности. Обавезно изаберите пуфер са пКа вредношћу близу радног пХ који вам је потребан! На пример, фосфат (пКа ~ 7,2) се често користи у неутралном пХ опсегу, а Трис (пКа ~ 8,1) се често користи у алкалном.
Компатибилност:Размислите да ли компоненте пуфера ометају вашу експерименталну реакцију (нпр. фосфат може ометати неке студије фосфорилације, а борат може реаговати са шећерима).
Јонска снага и температура:Јонска снага утиче на активност ензима, растворљивост итд.; промене температуре могу значајно утицати на пКа вредност пуфера као што је Трис (Трис има велики пКа температурни коефицијент од око -0,031/степен).
Ⅳ. Листа уобичајених бафера
1. ПБС пуфер серија
ПБС пуфер 1× (пХ7,4), ПБС пуфер 10× (пХ7,4), ПБС фосфатни прах (без јона калцијума и магнезијума): прање ћелија у експериментима ћелијске културе (као пре промене медијума за културу); разблаживање антитела и прање ЕЛИСА плоча у имунолошким експериментима; одржавање осмотског притиска и пХ стабилности у експериментима протеина/нуклеинске киселине итд.
ДПБС пуфер (без калцијума и магнезијума), ДПБС фосфатни прах (без јона калцијума и магнезијума): проточна цитометрија у ћелијским експериментима, прање након ћелијске дигестије (да би се избегло мешање калцијума и магнезијума у активности ензима); разблаживање ензима или извођење експеримената{0}}осетљивих на јоне у молекуларној биологији (као што су одређене ПЦР реакције) итд.
ПБСТ пуфер (1×), ПБСТ пуфер (10×): користи се за кораке блокирања и испирања у Вестерн Блоту или имунохистохемији, смањујући неспецифично везивање, итд.
2. ТБС пуфер серија
ТБС пуфер (1×), ТБС пуфер (10×): заменити ПБС пуфер у имунолошким експериментима (да би се избегла интерференција фосфата са одређеним везивањем антитела); стабилизовати алкално пХ окружење у протеинским експериментима итд.
3. ХБСС пуфер серија
ХБСС пуфер (без калцијума и магнезијума, без фенол црвеног)/Ханков пуфер (без калцијума и магнезијума): раздвајање ћелија и центрифугално прање у ћелијским експериментима (као што је проточна цитометрија); -краткорочно одржавање ћелија (као што је снимање живих ћелија), итд. ХБСС пуфер (без калцијума и магнезијума, без фенол црвеног): одржава метаболичку активност ћелије у ћелијској култури (калцијум и магнезијум учествују у трансдукцији сигнала); експерименти миграције/инвазије ћелија.
4. ТЕ пуфер серија
ТЕ пуфер (1×), ТЕ пуфер (10×): растворити и ускладиштити ДНК/РНА (Трис одржава пХ, ЕДТА хелатира металне јоне да инхибира активност нуклеазе); разблажену ДНК за ПЦР, секвенцирање и друге експерименте.
5. Серија пуфера за електрофорезу
ТАЕ пуфер (1×): конвенционална електрофореза ДНК агарозног гела (ниска резолуција, погодна за велике фрагменте ДНК). ТБЕ пуфер (1×), ТБЕ пуфер (10×): ДНК/РНА електрофореза високе-резолуције (као што су мали фрагменти или електрофореза у полиакриламидном гелу); дуготрајна-електрофореза (капацитет пуфера је бољи од ТАЕ).
6. Серија пуфера за Вестерн блот експеримент
Вестерн блот трансфер пуфер (10×): Пуфер који се користи за пренос протеина са гела на мембрану (као што је ПВДФ мембрана), који садржи Трис, глицин и метанол.
Трис-ХЦл пуфер (1мол/Л, пХ6,8): Припрема СДС-ПАГЕ концентрованог гела, итд.
Трис-ХЦл пуфер (1,5мол/Л, пХ8,8): Припрема СДС-ПАГЕ гела за одвајање, итд.
7. Стандардна серија пХ пуфера
пХ=4.00/6,86/9,18 пуфер (припремљен 250мЛ): стандардни раствор за калибрацију пХ метра (нпр. пХ6,86 је неутрални стандард, пХ4,00 и 9,18 су кисели и алкални стандарди).
Пуферски реагенси никако нису основна помоћна улога у лабораторији. Њихова основна вредност лежи у обезбеђивању прецизног и стабилног протонског окружења, што је камен темељац за одржавање термодинамичке равнотеже и кинетичке брзине већине биохемијских реакција. Од регулације микроокружења активних места ензима, до гаранције конформационе стабилности биомакромолекула, до одржавања трансмембранских градијената јона, пХ пуферски капацитет пуфер система је неопходан предуслов за поновљивост и поузданост експерименталних података. Беекман ће вас испратити на ваше научно истраживачко путовање.
Хунан БКМАМ Холдинг Цо., Лтд
Веб сајт: ввв.бкмбио.цом
Е-пошта:info@bkmbio.com